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      ELISA操作常見問題和解決方法
      來源:Genenode|君諾德公司     發(fā)布時間:2016-04-16     Hits:5137

      ELISA即酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn),是目前廣泛應(yīng)用于各種抗原抗體檢測的方法,主要有靈敏度高和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。ELISA操作步驟看似簡單,整個測定過程中卻有諸多影響因素,導(dǎo)致檢測結(jié)果可能與實(shí)際結(jié)果偏差較大。為幫助大家分析實(shí)驗(yàn)中常見問題,我們將常見問題的可能原因和解決方法歸納總結(jié)于下表:

       

      問題一:高背景或陰性對照值偏高

      可能原因

      建議

      陰性對照孔被陽性對照或樣品污染

      洗滌時,勿將洗液溢出孔外。

      洗滌不充分

      確保在洗滌時每個孔都充滿了液體,確保將殘余液體從孔中移除。

      酶結(jié)合物過濃

      請檢查酶結(jié)合物是否按說明書規(guī)定稀釋

      孵育溫度過高

      檢查孵育箱的溫度是否正確、穩(wěn)定

      底物在使用前曝光

      應(yīng)保存在暗處,避光。

      讀板前停留時間過長

      加終止液后3分鐘內(nèi)讀數(shù)

       

      問題二:陽性對照值偏低或低吸光度

      可能原因

      建議

      蒸發(fā)

      各步之間,須使用封版膠密封反應(yīng)板。

      溫度不均勻

      校準(zhǔn)孵育箱,勿疊放反應(yīng)板。

       

      問題三:邊緣效應(yīng)

      可能原因

      建議

      蒸發(fā) 

      各步之間,須使用封版膠密封反應(yīng)板

      溫度不均勻 

      校準(zhǔn)孵育箱,勿疊放反應(yīng)板

       

      問題四:標(biāo)準(zhǔn)曲線不佳 

      可能原因

      建議

      倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品時未混勻 

      稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的每一步均需混勻

      過早稀釋

      標(biāo)準(zhǔn)品在快要使用時稀釋

      加入的體積不正確

      使用校準(zhǔn)過的移液器,快速、等量的將標(biāo)準(zhǔn)品分配到各個微孔中

       

      問題五:標(biāo)準(zhǔn)曲標(biāo)準(zhǔn)曲線良好,但樣本無檢測信號

      可能原因

      建議

      樣本中無檢測物或檢測物含量極低

      設(shè)置內(nèi)參,重新實(shí)驗(yàn)

      樣本中其他物質(zhì)影響/掩蓋檢測

      作適當(dāng)稀釋,降低其他物質(zhì)的干擾,或作系列稀釋,檢測回收率。

      樣本中檢測物濃度過高,Hook效應(yīng)導(dǎo)致假低值

      適當(dāng)倍數(shù)稀釋樣本,檢測物濃度盡量在試劑盒檢測范圍內(nèi)。

       

      問題六:重復(fù)性較差

      可能原因

      建議

      微孔中有氣泡

      用針尖挑破氣泡

      試劑未混勻

      確保充分混勻試劑

      樣本中有雜質(zhì)或沉淀物

      使用前離心

      微孔包被面被吸頭劃破

      加液時小心操作

      使用用過的封板膠紙

      每次須使用新的封板膠封住反應(yīng)孔


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