產(chǎn)品中心

植物microRNA提取試劑盒(離心柱型)

Plant microRNA Extraction Kit(Column)

包裝規(guī)格：

一.產(chǎn)品介紹：
植物microRNA快速提取試劑盒，獨(dú)特的裂解液迅速裂解細(xì)胞和滅活細(xì)胞RNA酶，植物RNA助提劑PLANTaid幫助結(jié)合多糖多酚并通過離心去除，然后裂解混合物通過基因組DNA清除柱，基因組DNA被清除而RNA（包括microRNA）被選擇性濾過。濾過的RNA用乙醇調(diào)節(jié)結(jié)合條件后，RNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜， 再通過一系列特殊漂洗液快速的漂洗－離心的步驟,將細(xì)胞代謝物，蛋白等雜質(zhì)去除， 最后低鹽的RNase free H20將純凈RNA（包括microRNA）從硅基質(zhì)膜上洗脫。采用分提取操作步驟也可單獨(dú)純化富集后的microRNA組分和總RNA（>200 nt）從而得到分離富集的microRNA和RNA。

二.產(chǎn)品特點(diǎn)：
1.完全不使用有毒的苯酚，氯*等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。
2.快速，簡捷，單個樣品操作一般可在30分鐘內(nèi)完成。
3.獨(dú)有的植物RNA助提劑可以有效結(jié)合多糖多酚,提高清除效果。
4.多次柱漂洗確保高純度，OD260/OD280典型的比值達(dá)2.0～2.2，可用于RT-PCR，Northern-blot和各種實(shí)驗(yàn)。

三.適用范圍：

    適用于快速提取植物microRNA或者microRNA/總RNA分別提取。

四.儲存條件：
1.所有的溶液應(yīng)該是澄清的，如果環(huán)境溫度低時溶液可能形成沉淀，此時不應(yīng)該直接使用，可在37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清。
2.不合適的儲存于低溫（4℃或者－20℃）會造成溶液沉淀，影響使用效果，因此運(yùn)輸和儲存均在室溫下（15℃－25℃）進(jìn)行。
3.Wash Solution 2/3可能加入乙醇使用幾天后出現(xiàn)沉淀晶體，并不影響使用，直接不吸晶體，吸上清使用就可以。
4.避免試劑長時間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、PH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時蓋緊蓋子。

五.注意事項(xiàng)：
1.所有的離心步驟均可在室溫完成（4℃離心也可以），使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13,000 rpm的傳統(tǒng)臺式離心機(jī)，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機(jī)。

2.需要自備乙醇，β-巰基乙醇，研缽(可選)。

3.樣品處理量絕對不要超過基因組清除柱DA和和RNA吸附柱RA處理能力，否則造成DNA殘留或產(chǎn)量降低。開始摸索實(shí)驗(yàn)條件時，如果不清楚樣品DNA/RNA含量時可使用較少的樣品處理量，將來根      據(jù)樣品試驗(yàn)情況增加或者減少處理量。

4.裂解液RLT Plus 和Wash Solution 1中含有刺激性化合物，操作時戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，用大量清水或者生理鹽水沖洗。 

5.關(guān)于DNA 的微量殘留：
  一般說來任何總RNA提取試劑在提取過程中無法完全避免DNA的微量殘留（DNase消化也無法做到100%無殘留），該產(chǎn)品由于采取了本公司獨(dú)特的緩沖體系和基因組DNA清除柱技術(shù)，絕大多數(shù)DNA已經(jīng)被清除，個別特殊情況需要清除微量基因組DNA殘留，可使用以下幾種DNA酶消化的方式。

 1)傳統(tǒng)DNA酶消化提取的RNA/microRNA，熱滅活DNA酶后直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

 2)傳統(tǒng)DNA酶消化提取的RNA/microRNA，然后使用RNA清潔純化試劑盒（貨號：2131)清潔純化后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

 3)直接在吸附柱RA上進(jìn)行DNase I柱上消化處理。購買DNA酶柱上消化試劑盒(貨號：2127) 。

6.碰到特別復(fù)雜多糖多酚，淀粉等次級代謝產(chǎn)物特別豐富的樣品，如葡萄果實(shí)，水稻種子，裂解液RLT Plus效果不佳的情況下，應(yīng)該購買專用裂解液CLB。

六.操作步驟：（實(shí)驗(yàn)前請先閱讀注意事項(xiàng)）
    第一次使用前請先在Wash Solution 1和Wash Solution 2/3瓶加入指定量無水乙醇!
    對于RNA酶或者多酚特別豐富植物組織：操作前在裂解液RLT Plus中加入β-巰基乙醇至終濃度1%，如1 ml RLT Plus 中加入10μl β-巰基乙醇。此裂解液最好現(xiàn)用現(xiàn)配。配好的RLT Plus 4℃可放置一個月。
1.直接研磨法（提取簡單植物樣品推薦此法，但是簡單樣品也可以用液氮研磨法）:

 a.新鮮植物組織稱重后取100mg迅速剪成小塊放入研缽（冰凍保存或者液氮保存樣品可直接稱重后取100mg放入研缽）， 加入10體積（1ml）RLT Plus和1體積（100μl） PLANTaid 室溫下充分研磨成勻漿，注意應(yīng)該迅速研磨讓組織和裂解液RLT Plus立刻充分接觸以抑制RNA酶活性。

注：PLANTaid是提取多糖多酚次級代謝產(chǎn)物色素含量豐富的困難樣品不可缺少成分。
 b.將裂解物轉(zhuǎn)入離心管，劇烈搖晃振蕩15秒，13，000rpm離心5-10分鐘,沉淀不能裂解的碎片和結(jié)合有多糖多酚的PLANTaid。

 c.取480μl裂解物上清（在不超過基因組DNA清除柱能力的情況下可以取更多的上清，這樣可以提高產(chǎn)量，如殘留基因組DNA較多，可適當(dāng)減少取上清量）將裂解物上清加到DNA清除柱上（清除柱      放在收集管內(nèi)）。

 d.立刻接操作步驟的步驟3。

2.液氮研磨法（提取復(fù)雜，易降解樣品時推薦此法）:

a.取500μl裂解液RLT Plus，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，加50μl PLANTaid混勻備用。

b.液氮中研磨適量植物組織成細(xì)粉后，取50mg細(xì)粉轉(zhuǎn)入上述裝有RLT Plus和PLANTaid的離心管, 立即用手劇烈振蕩20秒，充分裂解。

c.用吸頭吹打混勻幫助裂解或者劇烈渦旋震蕩直到得到滿意勻漿結(jié)果(或者電動勻漿30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高產(chǎn)量。

d.將裂解物13,000 rpm離心5-10分鐘，沉淀不能裂解的碎片和結(jié)合有多糖多酚的PLANTaid。

e.取裂解物上清（在不超過基因組DNA清除柱能力的情況下可以取更多的上清，這樣可以提高產(chǎn)量）將裂解物上清加到DNA清除柱上（清除柱放在收集管內(nèi)）。

f.立刻接操作步驟的步驟3。

注意：以上液氮研磨法用戶可以根據(jù)需要加倍處理，可以提高產(chǎn)量。也就是使用1ml的裂解液RLT Plus和100μl PLANTaid和100mg的樣品。
3.立即13,000 rpm離心60秒，收集濾液（RNA在濾液中）。

4.用微量移液器較精確估計濾過液體積（480μl左右，濾過時候損失體積應(yīng)該減去），加入1.25倍體積的無水乙醇，此時可能出現(xiàn)沉淀，但是不影響提取過程，立即吹打混勻，不要離心。

5.立刻將混合物(每次小于700μl，多可以分兩次加入)加入一個吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm離心30秒，棄掉廢液。
  確保離心后液體全部濾過去，膜上沒有殘留，如有必要，可以加大離心力和離心時間。

6.加700μl Wash Solution 1（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

7.加入500μl Wash Solution 2/3（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。加入500μl Wash Solution 2/3，重復(fù)一遍。

8.將吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。

9.取出吸附柱RA，放入一個RNase free離心管中，根據(jù)預(yù)期RNA產(chǎn)量在吸附膜的中間部位加30-50μl RNase free water， 室溫放置1分鐘，12,000 rpm 離心1分鐘。
  將洗脫液加回到吸附柱重復(fù)洗脫步驟一遍可以提高產(chǎn)量約10-15%。

10.得到的RNA/microRNA可以立即用于下游反應(yīng)或者盡快置于低溫保存。

附錄1：microRNA富集方法（microRNA/去除了microRNA的總RNA分別提取）
     第一次使用前請先在漂洗液RW瓶加入指定量無水乙醇!
     對于RNA酶或者多酚特別豐富植物組織：操作前在裂解液RLT Plus中加入β-巰基乙醇至終濃度1%，如1 ml RLT Plus 中加入10μl β-巰基乙醇。此裂解液最好現(xiàn)用現(xiàn)配。配好的RLT Plus 4℃可放置一個月。

1.直接研磨法（提取簡單植物樣品推薦此法，但是簡單樣品也可以用液氮研磨法）:

 a.新鮮植物組織稱重后取100mg迅速剪成小塊放入研缽（冰凍保存或者液氮保存樣品可直接稱重后取100mg放入研缽）， 加入10體積（1ml）RLT Plus和1體積（100μl） PLANTaid 室溫下充分研磨    成勻漿，注意應(yīng)該迅速研磨讓組織和裂解液RLT立刻充分接觸以抑制RNA酶活性。

注：PLANTaid是提取多糖多酚次級代謝產(chǎn)物色素含量豐富的困難樣品不可缺少成分。

 b.將裂解物轉(zhuǎn)入離心管，劇烈搖晃振蕩15秒，13，000rpm離心5-10分鐘,沉淀不能裂解的碎片和結(jié)合有多糖多酚的PLANTaid。

 c.取480μl裂解物上清（在不超過基因組DNA清除柱能力的情況下可以取更多的上清，這樣可以提高產(chǎn)量，如殘留基因組DNA較多，可適當(dāng)減少取上清量）轉(zhuǎn)到一個新離心管。加入上清體積一半的無水乙醇(0.5體積)，此時可能出現(xiàn)沉淀,但是不影響提取過程,立即吹打混勻,不要離心。

 d.立刻接富集方法的步驟3。

2.液氮研磨法（提取復(fù)雜，易降解樣品時推薦此法）:
 a.取500μl裂解液RLT Plus，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，加50μl PLANTaid混勻備用。

 b.液氮中研磨適量植物組織成細(xì)粉后，取50mg細(xì)粉轉(zhuǎn)入上述裝有RLT Plus和PLANTaid的離心管, 立即用手劇烈振蕩20秒，充分裂解。

 c.用吸頭吹打混勻幫助裂解或者劇烈渦旋震蕩直到得到滿意勻漿結(jié)果(或者電動勻漿30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高產(chǎn)量。

 d.將裂解物13,000 rpm離心5-10分鐘，沉淀不能裂解的碎片和結(jié)合有多糖多酚的PLANTaid。

 e.取裂解物上清（在不超過基因組DNA清除柱能力的情況下可以取更多的上清，這樣可以提高產(chǎn)量）轉(zhuǎn)到一個新離心管。加入上清體積一半的無水乙醇(0.5體積)，此時可能出現(xiàn)沉淀,但是不影響提    取過程，立即吹打混勻,不要離心。

 f.立刻接富集方法的步驟3。
注意：以上液氮研磨法用戶可以根據(jù)需要加倍處理，可以提高產(chǎn)量。也就是使用1ml的裂解液RLT Plus和100μl PLANTaid和100mg的樣品。

3.將混合物(每次小于720μl，多可以分兩次加入)加入一個基因組清除柱中，（清除柱放入收集管中）13,000 rpm離心2分鐘，保留濾液（microRNA在濾液中）。此時，濾過液含有microRNA，基因組DNA清除柱子上面是去除了microRNA的總RNA（不包含microRNA），如果需要，可以按照前面標(biāo)準(zhǔn)操作步驟6－10操作漂洗，洗脫回收得到去除了microRNA的總RNA。

4.用微量移液器較精確估計濾過液體積，加入0.65倍體積無水乙醇（必須是室溫的），渦旋或者吹打充分混勻，不要離心。

5.立刻將混合物(每次小于700μl，多可以分兩次加入)加入一個吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm離心2分鐘，棄掉廢液。確保離心后液體全部濾過去，膜上沒有殘留，如有必要，可以加大離心力和離心時間。

6.按照前面標(biāo)準(zhǔn)操作步驟6－10操作漂洗，洗脫得到富集的microRNA。 
注意：不同的實(shí)驗(yàn)可以選擇不同的方法，例如Northern Blot或者表達(dá)芯片譜分析可以選擇提取包括microRNA的總RNA。富集方法提取的microRNA因?yàn)槿コ溯^大片段的mRNA和rRNA等，可能減少某些下游試驗(yàn)的擴(kuò)增背景，當(dāng)背景較高或者非特異擴(kuò)增較多時，可以嘗試使用富集方法提取的microRNA。

附錄2：DNA酶柱上消化（詳細(xì)請參考2127 DNase I 柱上消化試劑盒說明書)
1.按照前面所列操作步驟操作，直到做完操作步驟5。
2.取45μl DNase I buffer和5μl RNase free DNase I在離心管輕輕吹打混勻成工作液（處理多個離心柱子要按照比例放大制備工作液）。

3.向吸附柱RA 中加入350μl Wash Solution 1，12,000 rpm 離心30 秒，棄廢液，將吸附柱放回收集管中。

4.向吸附柱RA 中央加入50μl的DNase I 工作液，室溫（20℃-30℃）放置15 分鐘。注意直接將工作液滴在膜中央上向膜四周浸潤充分和膜接觸，不要讓工作液滴在O型墊圈或是離心柱管壁上掛壁或    者掛在墊圈上不能充分和膜接觸。

5.向吸附柱RA 中加入350μl Wash Solution 1， 12,000 rpm 離心30-60 秒，棄廢液，將吸附柱放回收集管中。

6.接操作步驟7完成后續(xù)步驟。

附錄3：植物microRNA快速提取試劑盒使用裂解液CLB操作步驟
      第一次使用前請先在Wash Solution 1和Wash Solution 2/3瓶加入指定量無水乙醇!
      取1ml裂解液 CLB至離心管內(nèi)(如果CLB有析出或者沉淀需先置于65°C水浴重新溶解）， 在裂解液CLB中加入5%?-巰基乙醇（1ml CLB加50μl ?-巰基乙醇）。顛倒混勻后65°C水浴中預(yù)熱。
1.液氮中研磨新鮮或-70°C冷凍的材料至細(xì)粉。

2.轉(zhuǎn)移100-150mg細(xì)粉（水分少的樣品如種子葉片等可加100mg，水分多的樣品如西瓜可多加一些）加至預(yù)熱的裂解液CLB（已加有?-巰基乙醇）離心管中，立即激烈渦旋30－60秒或者用吸頭吹打   混勻裂解，短時放回 65°C水浴中（5 min），中間偶爾顛倒1-2次幫助裂解。
  ?-巰基乙醇是裂解液CLB的關(guān)鍵成分，必要的時候可以提高終濃度到10-20%。
3.振蕩混勻后室溫13,000rpm離心10分鐘。

4.取裂解物上清（在不超過基因組DNA清除柱能力的情況下可以取更多的上清，這樣可以提高產(chǎn)量）轉(zhuǎn)到一個新離心管。
  若上清表面有漂浮物，用吸頭挑開吸取下面液體即可。

5.立刻接后續(xù)操作步驟。

具體產(chǎn)品折扣價，請郵件或QQ咨詢！
E-mail：[email protected]
Wechat：18518676727/17307107886
Q Q：1195537948 / 1751728433