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Components	Volumn	Final Concentration
Total RNA	xμl	Up to 2μg
E.coliPoly(A) Polymerase(5U/μl)	0.4μl(見(jiàn)注意事項(xiàng))	2U
10×Poly(A) Polymerase Buffer	2μl	1 X
10× rATP solution	2μl	1 X
RNase free H2O to final volume	20μl

注意事項(xiàng)：E.coli Poly(A) Polymerase(5U/μl)非常粘稠和微量，溶液容易吸附在管壁和吸頭外導(dǎo)致?lián)p失，用前請(qǐng)點(diǎn)甩離心后使用，并且避免吸頭外壁沾附損失?？梢悦看伟凑?.3μl使用，也不影響使用效果。
*在反應(yīng)中使用的total RNA 必須含有小分子RNA。
*此過(guò)程也可以使用小分子RNA（建議加入量為2μl ~4μl。請(qǐng)根據(jù)目的miRNA豐度決定加入量）。
2. 移液器輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液，短暫離心后在37℃反應(yīng)30-60 min。所得的Poly(A)反應(yīng)液可以立即進(jìn)行第一鏈合成，也可以放置-20℃短暫保存。如需長(zhǎng)期保存建議存放于-80℃。

二、加Poly (A)修飾后的miRNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（第一鏈合成）
1. 按照下表組分冰上進(jìn)行反應(yīng)液的配制

Components	Volume
上述Poly(A)反應(yīng)液	2 -4μl
25μmol RT primer	2 μl
5×RT Reaction Mix	4 μl
TUREscript Hˉ RTase (200U/μl)	0.8-1μl (見(jiàn)注意事項(xiàng))
RNase free H2O to final volume	20 μl

注意事項(xiàng)：TUREscript Hˉ RTase非常粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸頭外導(dǎo)致?lián)p失，用前請(qǐng)點(diǎn)甩離心后使用，并且避免吸頭外壁沾附損失。可以每次按照0.8μl使用，也不影響使用效果。
2. 移液器輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液，短暫離心后在42℃反應(yīng)50min。
3. 70℃加熱15 min失活TUREscript Hˉ RTase。合成的cDNA反應(yīng)液可放置于-20℃保存；也可以直接進(jìn)行下游PCR或者熒光定量PCR檢測(cè)。

注：按照上述操作步驟得到的cDNA模板用于下游PCR或者熒光定量PCR檢測(cè)時(shí)，可以根據(jù)實(shí)際情況選擇使用量，如果發(fā)現(xiàn)有非特異擴(kuò)增條帶，或者融鏈曲線顯示有非特異擴(kuò)增，往往提示cDNA模板過(guò)量， 可以將上述cDNA模板稀釋幾十到幾百倍甚至上千倍再使用。