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FFPE石蠟包埋組織microRNA提取試劑盒(離心柱型)

FFPE Tissue microRNA Extraction Kit(Column)

包裝規(guī)格：

一.產(chǎn)品介紹：

本試劑盒設(shè)計用于快速從福爾馬林固定、石蠟包埋組織樣品中提取RNA包括microRNA。獨特的裂解液/蛋白酶K迅速裂解細胞釋放出RNA，然后裂解混合物通過一個基因組DNA清除柱，基因組DNA被清除而RNA穿透濾過。濾過的RNA用乙醇調(diào)節(jié)結(jié)合條件后,RNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜， 再通過一系列快速的漂洗-離心的步驟, 去蛋白液和漂洗液將細胞代謝物，蛋白等雜質(zhì)去除， 最后低鹽的RNase free H20將純凈RNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。得到的RNA可用于反轉(zhuǎn)錄PCR、熒光定量PCR等實驗。

二.產(chǎn)品特點：
1.完全不使用有毒的苯酚，氯*等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。
2.快速，簡捷，單個樣品RNA提取操作一般可在1小時內(nèi)完成。
3.試劑盒的獨家基因組清除柱和配方確保有效清除基因組DNA殘留，一般情況下得到的RNA不需要DNase消化，可直接用于反轉(zhuǎn)錄PCR、熒光定量PCR等實驗。
4.多次柱漂洗確保RNA高純度，可直接用于下游各種實驗。

三.適用范圍：
適用于快速從福爾馬林固定、石蠟包埋組織樣品中提取RNA包括microRNA，RNA可直接用于反轉(zhuǎn)錄PCR，熒光定量PCR.。

四.儲存條件：
1.所有的溶液應(yīng)該是澄清的，如果環(huán)境溫度低時溶液可能形成沉淀，此時不應(yīng)該直接使用，可在37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清。
2.不合適的儲存于低溫（4℃或者－20℃）會造成溶液沉淀，影響使用效果，因此運輸和儲存均在室溫下（15℃－25℃）進行。
3.Wash Solution 2/3可能加入乙醇使用幾天后出現(xiàn)沉淀晶體，并不影響使用，直接不吸晶體，吸上清使用就可以。
4.為避免降低活性，方便運輸，提供蛋白酶K為凍干粉狀，收到后，可短暫離心后，加入0.5毫升滅菌水溶解。因為反復(fù)凍融可能會降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量)分裝凍存，－20℃保存。
5.避免試劑長時間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、PH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時蓋緊蓋子。

五.注意事項：
1.所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達到13,000 rpm的傳統(tǒng)臺式離心機，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機。

2.樣品處理量絕對不要超過基因組DNA清除柱和RNA吸附柱RA處理能力，否則造成DNA殘留或者產(chǎn)量降低。不同組織細胞種類RNA/DNA相差極大，例如胸腺脾臟DNA含量豐富，超過5mg就會超過柱子處理能力。COS細胞RNA含量豐富，超過3x106細胞就會超過柱子吸附能力。所以開始摸索實驗條件時，如果不清楚樣品DNA/RNA含量時寧可使用較少的樣品處理量，如不超過2個10μm厚度石蠟切片。將來根據(jù)樣品試驗情況增加或者減少處理量。

3.裂解液PKD、結(jié)合液RBC中含有刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。

4.預(yù)防RNase 污染，應(yīng)注意以下幾方面：
 1)經(jīng)常更換新手套。因為皮膚經(jīng)常帶有細菌，可能導(dǎo)致RNase 污染。
 2)使用無RNase 的塑料制品和槍頭避免交叉污染。
 3)RNA提取過程中應(yīng)使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4 小時，塑料器皿可在0.5 M NaOH 中浸泡10 分鐘，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase。
 4)配制溶液應(yīng)使用無RNase 的水。（將水加入到干凈的玻璃瓶中，加入DEPC至終濃度0.1%( v/v)，37℃放置過夜，高壓滅菌。）

5.關(guān)于DNA 的微量殘留：
  一般說來任何總RNA提取試劑在提取過程中無法完全避免DNA的微量殘留（DNase消化也無法做到100%無殘留），本公司的EASYspin固定包埋組織microRNA快速提取試劑盒，由于采取了本公司獨特的緩沖體系和基因組DNA清除柱技術(shù)，絕大多數(shù)DNA已經(jīng)被清除，可直接用于反轉(zhuǎn)錄PCR和熒光定量PCR。個別特殊情況如DNA含量過于豐富造成殘留或者要進行嚴格的mRNA表達量分析熒光定量PCR，我們建議在進行模板和引物的選擇時：
 1)選用跨內(nèi)含子的引物,以穿過mRNA中的連接區(qū),這樣DNA就不能作為模板參與擴增反應(yīng)。
 2)選擇基因組DNA和cDNA上擴增的產(chǎn)物大小不一樣的引物對。

6.RNA 純度及濃度檢測：
完整性：RNA 可用普通瓊脂糖凝膠電泳 (電泳條件：膠濃度1.2%；0.5×TBE電泳緩沖液；150v，15 分鐘)檢測完整性。由于石蠟包埋組織福爾馬林固定和包埋過程中一般由于RNA與蛋白反應(yīng)交聯(lián)會導(dǎo)致RNA斷裂或者降解，一般電泳后UV 下只能看到模糊彌散（smear）帶型，隨著儲存的時間越長，降解斷裂越嚴重，甚至只能看到峰值僅僅在100bp左右的模糊條帶。這都屬于RNA提取正常情況。
純度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白質(zhì)污染程度的參考指標。高質(zhì)量的RNA，OD260/OD280 讀數(shù)（10mMTris, pH7.5）在1.8-2.1 之間。OD260/OD280 讀數(shù)受測定所用溶液的pH 值影響。同一個RNA 樣品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中測出的OD260/OD280 讀數(shù)1.8-2.1 之間，在水溶液中所測讀數(shù)則可能在1.5-1.9 之間，但這并不表示RNA 不純。
濃度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free 水稀釋n 倍，用RNase-free水將分光光度計調(diào)零，取稀釋液進行OD260, OD280 測定，按照以下公式進行RNA濃度的計算：終濃度（ng/μl）= (OD260)×(稀釋倍數(shù)n)×40。

六.操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）
   提示：      第一次使用前請先在漂洗液RW瓶中加入指定量無水乙醇!

1.修整去除過量包埋組織外石蠟，并切片成10-20μm厚切片。切片厚度必須≥10μm，否則太薄會切碎細胞，造成脫蠟過程中microRNA丟失。

2.收集總厚度不超過■40μm的石蠟切片到一個1.5-2ml離心管（例如2片20μm、4片10μm的石蠟切片），或者不超過▲80μm的石蠟切片到一個2ml離心管。
■代表處理切片總厚度≤40μm，▲代表處理切片總厚度≤80μm

3.加入1ml 100%二甲苯，渦旋振蕩10秒。瞬間離心把組織全部浸入到二甲苯。

4.50℃水浴3分鐘熔解石蠟，20-25℃最高速離心2分鐘，收集組織到管底。

5.小心用移液器吸棄上清二甲苯，注意不要吸到沉淀。

6.加入1ml無水乙醇，渦旋振蕩，最高速離心2分鐘，小心吸棄上清乙醇。

7.加入1ml無水乙醇，重復(fù)步驟6一遍，盡可能吸棄所有乙醇。

8.室溫或者37℃ 晾干乙醇10分鐘或直到所有乙醇揮發(fā)干。乙醇完全晾干非常重要，微量的乙醇殘留也會導(dǎo)致RNA產(chǎn)量降低。

9.吹打或者渦旋振蕩充分重懸組織沉淀在■150μl ▲240μl 裂解液PKD中，短暫離心收集液體到管底，加10μl 蛋白酶K，吹打混勻。

10.55℃孵育15分鐘，然后80 ℃孵育15分鐘。55℃孵育后，可以將離心管取出放置在室溫，等水浴鍋溫度升到80℃后再放入水浴鍋，精確的孵育15分鐘。即使2分鐘的延長也可能導(dǎo)致RNA的部分降解。

11.加入■320μl ▲500μl 結(jié)合液RBC，充分吹打混勻調(diào)節(jié)結(jié)合條件。

12.立刻將混合物加入一個基因組DNA清除柱中，（清除柱放入收集管中）14,000 rpm離心30秒，保留濾過液（RNA在濾過液中）。應(yīng)避免吸到可能有的較大的未消化完全的絮團物質(zhì)上柱子，以免堵塞離心柱。

13.加入■1120μl ▲1750μl 無水乙醇到濾過液中，立即吹打混勻，不要離心。如果加1750μl無水乙醇，應(yīng)先將濾過液轉(zhuǎn)到容量超過3ml的離心管后再加入。

14.立刻將混合物(每次小于700μl，多可以分多次加入)加入一個RNA吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm離心30秒，棄掉廢液。

15.加入500μl漂洗液RW（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。加入500μl漂洗液RW,重復(fù)一遍。

16.將吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。

17.取出吸附柱RA，放入一個RNase free離心管中，根據(jù)預(yù)期RNA產(chǎn)量在吸附膜的中間部位加30μl RNase free water（事先在 70-90℃水浴中加熱可提高產(chǎn)量）， 室溫放置1分鐘，12,000 rpm 離心1分鐘。

洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要RNA濃度較高，可以適當(dāng)減少洗脫體積，如果需要RNA濃度高，可以將洗脫液放回吸附柱RA，再洗脫一遍。

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