產(chǎn)品中心

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱法)

Bacteria DNA Extraction Kit(Column)

包裝規(guī)格：

一.產(chǎn)品介紹：
獨(dú)特的結(jié)合液/蛋白酶K迅速裂解細(xì)胞和滅活細(xì)胞內(nèi)核酸酶，然后基因組DNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜， 再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟，抑制物去除液和漂洗液將細(xì)胞代謝物，蛋白等雜質(zhì)去除， 最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

二.產(chǎn)品特點(diǎn)：
1.離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜采用進(jìn)口公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復(fù)性好?？朔藝a(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。
2.不需要使用有毒的苯酚等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。
3.快速，簡(jiǎn)捷，單個(gè)樣品操作一般可在30分鐘內(nèi)完成。
4.多次柱漂洗確保高純度，OD260/OD280典型的比值達(dá)1.7～1.9，長(zhǎng)度可達(dá)30kb -50kb，可直接用于PCR，Southern-blot和各種酶切反應(yīng)。

三.適用范圍：
   適用于快速提取各種細(xì)菌基因組DNA。

四.儲(chǔ)存條件：
1.結(jié)合液CB或者抑制物去除液IR低溫時(shí)可能出現(xiàn)析出和沉淀，可以在37℃水浴幾分鐘幫助重新溶解，恢復(fù)澄清透明后冷卻到室溫即可使用。
2.為避免降低活性，方便運(yùn)輸，提供蛋白酶K為凍干粉狀，收到后，可短暫離心后，加入1毫升滅菌水溶解，因?yàn)榉磸?fù)凍融可能會(huì)降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量(20微升)分裝凍存，－20℃保存。
3.避免試劑長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時(shí)蓋緊蓋子。

五.注意事項(xiàng)：
1.所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13,000rpm的傳統(tǒng)臺(tái)式離心機(jī)，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機(jī)。
2.開始實(shí)驗(yàn)前根據(jù)需要將水浴預(yù)熱到37℃或者70℃?zhèn)溆谩?br /> 3.需要自備異丙醇。
4.需自備0.5M EDTA、Triton X-100和Lysozyme（溶菌酶）(用于革蘭氏陽性菌)。
5.結(jié)合液CB 和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，用大量清水或者生理鹽水沖洗。
  洗脫液EB不含有螯合劑EDTA，不影響下游酶切、連接等反應(yīng)。也可以使用水洗脫，但應(yīng)該確保批pH大于7.5， pH過低影響洗脫效率。用水洗脫DNA應(yīng)該保存在－20℃。DNA如果需要長(zhǎng)期保存，可以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影響下游酶切反應(yīng)，使用時(shí)可以適當(dāng)稀釋。

六.操作步驟：（實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)先閱讀注意事項(xiàng)）
   提示：第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液WB中加入指定量無水乙醇，充分混勻，加入后請(qǐng)及時(shí)在方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入!

1.取0.5-2毫升培養(yǎng)菌液（最多不超過2×109個(gè)細(xì)胞），10,000rpm，離心30秒，盡可能的吸棄上清，收集菌體。
起始處理量可以根據(jù)細(xì)菌密度、細(xì)胞種類、預(yù)期產(chǎn)量進(jìn)行調(diào)整，但是離心吸附柱最大吸附能力是20μg基因組DNA，如果菌體過量超過最大吸附能力，反而會(huì)嚴(yán)重降低產(chǎn)量。

2.加入200μl緩沖液RB重懸，10,000rpm離心30秒，棄上清。將細(xì)胞振蕩或者吹打充分重懸于180μl緩沖液RB中。
注意：對(duì)于較難破壁的革蘭氏陽性菌，可略過第2步驟，加入溶菌酶進(jìn)行破壁處理，具體方法為：加入180 μl緩沖液(20 mM Tris, pH 8.0；2 mM Na2-EDTA；1.2% Triton X-100；臨用前加入終濃度為20 mg/ml的溶菌酶(溶菌酶必須用溶菌酶干粉溶解在緩沖液中進(jìn)行配制，否則會(huì)導(dǎo)致溶菌酶無活性))，37 ℃處理30 min以上。

3.加入20μl蛋白酶K (20mg/ml)溶液，充分混勻，再加入200μl 結(jié)合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻，在70℃放置10分鐘。
可選做步驟: 如果RNA殘留較多，需要去除RNA，可以在加入200μl 結(jié)合液CB 前加4μl RNase A(100mg/ml)溶液，振蕩混勻，室溫放置5-10分鐘。

4.冷卻后加入100μl 異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。
上述步驟中立刻渦旋或者吹打充分混勻非常重要，混勻不充分嚴(yán)重降低產(chǎn)量，必要時(shí)如樣品粘稠不易混勻時(shí)可以渦旋振蕩15秒混勻。

5.將上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一個(gè)吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液。

6.加入500μl抑制物去除液IR，12,000 rpm 離心30秒，棄廢液。

7.加入600μl漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。

8.加入600μl漂洗液WB，12,000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。

9.將吸附柱AC放回空收集管中，13,000 rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。

10.取出吸附柱AC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水浴中預(yù)熱效果更好）， 室溫放置3-5分鐘，12,000 rpm 離心1分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,000 rpm離心1分鐘。
洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要DNA濃度較高，可以適當(dāng)減少洗脫體積， 但是最小體積不應(yīng)少于30μl，體積過小降低DNA洗脫效率，減少DNA產(chǎn)量。

11.DNA可以存放在2-8℃,如果要長(zhǎng)時(shí)間存放，可以放置在－20℃。