產(chǎn)品中心

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(溶液型)

Bacteria DNA Isolation Kit(Solution)

包裝規(guī)格：

一.產(chǎn)品介紹：
本試劑盒用于快速的從各種細(xì)菌中提取基因組DNA。細(xì)菌樣品加入細(xì)胞核裂解液(或者通過(guò)溶菌酶或者其它一些酶幫助裂解細(xì)胞壁后)，首先在強(qiáng)去污劑作用下裂解細(xì)胞釋放出基因組DNA，接著加入RNase A去除RNA，然后蛋白沉淀液選擇性沉淀去除蛋白，最后純凈的基因組DNA通過(guò)異丙醇沉淀并重溶解于DNA溶解液。

二.產(chǎn)品特點(diǎn)：
1.不需要使用有毒的苯酚等試劑。
2.快速，簡(jiǎn)捷，單個(gè)樣品操作一般可在30分鐘內(nèi)完成。
3.結(jié)果穩(wěn)定，產(chǎn)量高，OD260/OD280典型的比值達(dá)1.7～1.9，長(zhǎng)度可達(dá)50 kb -150kb，可直接用于構(gòu)建文庫(kù)，PCR，Southern-blot和各種酶切反應(yīng)。

三.適用范圍：
          適用于快速提取各種細(xì)菌基因組DNA。

四.儲(chǔ)存條件：
1.環(huán)境溫度低時(shí)細(xì)胞核裂解液中某些去污劑成份會(huì)析出出現(xiàn)渾濁或者沉淀，可在37℃水浴加熱幾分鐘，輕輕旋搖，即可恢復(fù)澄清，不要?jiǎng)×覔u晃，以免形成過(guò)量的泡沫。
2.蛋白沉淀液可能出現(xiàn)析出和沉淀，可以在37℃水浴幾分鐘幫助重新溶解，如果不能完全溶解，也不影響使用效果，直接取用上層溶液即可。
3.避免試劑長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時(shí)蓋緊蓋子。

五.注意事項(xiàng)：
1.所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13,000 rpm的傳統(tǒng)臺(tái)式離心機(jī)，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機(jī)。
2.用戶需自備異丙醇、70％乙醇、0.5M EDTA和Lysozyme（溶菌酶）(用于革蘭氏陽(yáng)性菌)、lysostaphin(用于某些難裂解的革蘭氏陽(yáng)性菌)、水浴箱。
3.開始實(shí)驗(yàn)前將需要的水浴先預(yù)熱好備用。
4.本試劑盒為溶液型，可以很容易的按照比例擴(kuò)大或者縮小每次處理的細(xì)菌細(xì)胞量，請(qǐng)聯(lián)系我們索取其它處理量的操作手冊(cè)。

六.操作步驟：（實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)先閱讀注意事項(xiàng)）
1.收集1毫升過(guò)夜培養(yǎng)細(xì)菌加入1.5毫升離心管。

2.9,000rpm離心30秒，使細(xì)胞沉淀下來(lái)，棄上清，渦旋或輕彈打散細(xì)胞沉淀。對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌，接步驟3。對(duì)革蘭氏陰性菌，直接接步驟6。

3.加入480μl 50mM EDTA完全重懸細(xì)胞。

4.加入120μl溶菌酶 (20mg/ml in 10 mM Tris-HCl，pH 8.0)，混勻。
對(duì)于大部分的革蘭氏陽(yáng)性菌如Bacillus subtilis，Micrococcus luteus，Arthrobacter luteus，Nocardia otitidiscaviarum，Rhodococcus rhodochrous和Brevibacterium albidium，使用溶菌酶就可以有效裂解。但是對(duì)于某些種類的Staphylococcus，則應(yīng)該加入60μl溶菌酶(20mg/ml)和60μl lysostaphin (20mg/ml)確保有效裂解。

5.37℃溫育30-60分鐘。12,000rpm離心2分鐘，棄上清，渦旋或輕彈打散細(xì)胞沉淀。

6.加入600μl細(xì)胞核裂解液至打散的細(xì)胞，輕柔吹打裂解細(xì)胞。

7.80℃溫育5分鐘裂解細(xì)胞，然后冷卻至室溫。

8.加入1.8μl RNase A（10mg/ml）至裂解物中至終濃度30μg/ml。顛倒混勻后37℃溫育15-60分鐘去除殘留RNA。然后室溫冷卻至少5分鐘使回復(fù)到室溫。

9.在回復(fù)到室溫的裂解物內(nèi)加入200μl蛋白沉淀液后，在渦旋振蕩器上高速連續(xù)振蕩混勻25秒?；靹蚝罂赡芤姷揭恍┬〉牡鞍讏F(tuán)塊。冰浴5分鐘。
由于樣品體積重量小，用渦旋振蕩器振蕩混勻產(chǎn)生的剪切力并不會(huì)剪切打斷基因組DNA。如果用手振蕩混勻，則不可以用手上下劇烈振蕩混勻，只能適當(dāng)力度振蕩混勻，否則會(huì)剪斷基因組DNA；但是力度也不能小，要保證充分混勻，將粘稠的裂解物打散開，否則DNA無(wú)法和蛋白質(zhì)沉淀分離開，離心的時(shí)候會(huì)和蛋白質(zhì)一起沉淀下來(lái)，造成DNA丟失或者降低產(chǎn)量。此外混勻不充分也可能造成蛋白沉淀不充分， 最后的產(chǎn)物污染有較大量的蛋白質(zhì)。因此建議用渦旋振蕩器。

10.13,000rpm離心5分鐘。這時(shí)候應(yīng)該可以見到管底白色的蛋白沉淀，也可能見到一些蛋白沉淀漂浮在液體表面。

11.小心吸取上清到一個(gè)新的1.5ml離心管中。
吸取上清時(shí)小心不要吸到管底的和漂浮在液體表面的蛋白沉淀，如果不小心將蛋白沉淀轉(zhuǎn)入新的離心管中，可再次離心2分鐘后取上清。

12.加入等體積的室溫異丙醇（約600μl），輕柔顛倒30次混勻或者直到出現(xiàn)棉絮狀（絲狀）白色DNA沉淀。
注意有時(shí)候棉絮狀（絲狀）DNA顛倒混勻的時(shí)候，粘附著在蓋子或者管口處，即使顛倒也不跟下來(lái)，這樣導(dǎo)致操作者看不到沉淀，誤認(rèn)為沒(méi)有得到DNA。解決辦法是略去步驟13，直接12,000rpm離心1分鐘，棄上清，然后接步驟15。

13.垂直放置離心管，讓白色DNA沉淀自然沉到管底，然后盡可能多的吸棄大部分的上清，注意不要吸到沉淀。

14.加入1ml 70％乙醇后，顛倒漂洗DNA沉淀，12,000rpm離心1分鐘，在管底可以見到白色的DNA沉淀塊，倒棄上清。

15.加入0.5ml70％乙醇，顛倒幾次漂洗DNA沉淀，12,000rpm離心1分鐘， 倒去上清（注意不要把DNA沉淀倒掉了），倒置后在吸水紙上輕敲幾下以控干殘留乙醇，還可以用槍頭小心吸掉管底沉淀周圍和管壁的殘留乙醇，空氣晾干沉淀幾分鐘。
注意不要干燥過(guò)頭，否則DNA極其難溶；也不能殘留太多乙醇，否則乙醇可能抑制下游如酶切反應(yīng)。

16.加入100μlDNA溶解液重新水化溶解DNA沉淀，輕彈管壁混勻，可以放置在65℃溫育30-60分鐘（不要超過(guò)一小時(shí)），中間不時(shí)的輕彈管壁幫助重新水化DNA。也可以在室溫或者4℃放置過(guò)夜來(lái)重新水化DNA，中間不時(shí)顛倒輕彈幫助溶解。

17.DNA可以存放在2-8℃，如果要長(zhǎng)時(shí)間存放，可以放置在－20℃。