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產(chǎn)品規(guī)格：

產(chǎn)品介紹：

本制品是采用Probe探針雜交法進(jìn)行Real Time PCR的專用試劑。將HotStart Taq DNA polymerase、dNTP、氯化鎂、特殊穩(wěn)定劑、優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液等試劑，預(yù)混成一種適合Real Time PCR反應(yīng)檢測(cè)用 2 × Premix Type試劑，減少PCR擴(kuò)增操作時(shí)間，避免因多步操作帶來的污染，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。本品采用全新的HotStart Taq DNA polymerase可以有效抑制非特異的PCR擴(kuò)增，大大提高擴(kuò)增效率，進(jìn)行高靈敏度的Real Time PCR反應(yīng)。

－20 ℃ 保存可保存1年，使用前充分融解混勻。短期使用可放在4 ℃，避免反復(fù)凍融。

使用方法：

3.1. 反應(yīng)體系配制
（1）溶解并混勻PCR反應(yīng)所需的各種溶液，放置于冰浴或冰盒內(nèi)。建議反應(yīng)PCR液體分裝使用，避免反復(fù)凍融。

（2）以50μl總反應(yīng)體積為例準(zhǔn)備反應(yīng)體系。如果反應(yīng)體積有變化，按比例調(diào)整用量。

建議PCR條件(分別以10μl，25 μl，50μl反應(yīng)體系為例，反應(yīng)液配制請(qǐng)?jiān)诒线M(jìn)行)

備注：

1) 引物終濃度應(yīng)在0.1-0.6μM之間進(jìn)行調(diào)節(jié)。一般情況下，終濃度為0.2μM的引物可以得到較好的結(jié)果；探針終濃度可在50nM-250nM之間進(jìn)行調(diào)整。
2) 關(guān)于加入模板的量，對(duì)于模板是基因組DNA，建議的模板量是10pg-1ug； 對(duì)于模板是反轉(zhuǎn)后得到的cDNA，使用體積不超過qPCR反應(yīng)液總體積的1/10，即20ul體系建議最多加入2ul cDNA，以此類推。
3) 各組分添加完之后，輕柔混勻反應(yīng)液。如果產(chǎn)生氣泡，低速離心以除去氣泡。

3.2. 反應(yīng)條件設(shè)置
以ABI 7500機(jī)型測(cè)試為例：

1) 預(yù)變性時(shí)間設(shè)置：由于本試劑用到的是抗體修飾酶，需要熱激活處理，一般建議預(yù)變性時(shí)間設(shè)為95℃，3min。 
2) 退火溫度和時(shí)間設(shè)置：請(qǐng)根據(jù)引物的Tm值和目的基因的長(zhǎng)度進(jìn)行調(diào)整。 
3) 熒光信號(hào)采集設(shè)置：請(qǐng)按照所使用的儀器需要的最短時(shí)間限制進(jìn)行調(diào)整，即Roche LightCycler 時(shí)長(zhǎng)設(shè)定為20sec、ABI7700/7900HT/7500Fast時(shí)長(zhǎng)設(shè)定為30sec、ABI 7000和ABI7300時(shí)長(zhǎng)設(shè)定為31sec、ABI7500時(shí)長(zhǎng)設(shè)定為34sec。

4. 結(jié)果分析：
4.1.擴(kuò)增結(jié)束無擴(kuò)增曲線：
1）模板量過少或已降解，提供高濃度和高質(zhì)量模板；
2）引物是否降解，可以通過PAGE膠確定其完整性；
3）反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠，一般將循環(huán)數(shù)設(shè)為40-45個(gè)循環(huán)；
4）確認(rèn)PCR程序設(shè)置中是否設(shè)置了熒光采集過程。

4.2.CT值出現(xiàn)過晚：
  1）擴(kuò)增效率低，反應(yīng)條件不夠優(yōu)化，可適當(dāng)降低退火溫度；
  2）模板濃度過低或加樣量不足；
  3）PCR產(chǎn)物過長(zhǎng)，一般PCR產(chǎn)物推薦長(zhǎng)度為80-150bp。

4.3.陰性對(duì)照有明顯擴(kuò)增：
1）Mix液、ddH2O、引物和探針可能存在污染，更換新的重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。