Zero Background pTOPO-TA Cloning Kit
零背景pTOPO-TA克隆試劑盒
包裝規(guī)格：
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V6001-20
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Zero Background pTOPO-TA Cloning Kit
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20T*10μL
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620元
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V6001-60
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Zero Background pTOPO-TA Cloning Kit
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60T*10μL
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1660元
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產(chǎn)品介紹：
本制品和傳統(tǒng)的T4連接酶原理不同，它利用了Topoisomerase可以在瞬間（幾秒鐘-幾分鐘）、高效（接近100%）連接DNA片段的原理。
1.可以在瞬間（幾秒鐘-幾分鐘）完成連接。
2.無需冰浴和熱休克，室溫5分鐘內(nèi)完成轉(zhuǎn)化；無需1小時(shí)復(fù)蘇，只需37℃10分鐘復(fù)蘇便可以涂板。從連接到涂板只需15-20分鐘。
3.無自連、零背景，無需繁瑣藍(lán)白斑篩選，見到長出的克隆便是有插入的（接近100%）。
4.可以連接長達(dá)10kb片段（即使連接5kb片段，挑10個(gè)菌落，至少8個(gè)是有插入的），是一種簡單、快速、零背景免篩選的TOPO TA克隆載體。
存儲(chǔ)溫度：-20℃保存，至少6個(gè)月不影響使用
測序可以采用 M13F/M13R通用引物測序（見后面圖譜）
操作步驟：
1.連接反應(yīng)的準(zhǔn)備：
PCR引物不能磷酸化。使用能在PCR產(chǎn)物末端加一個(gè)突出的3’-A的酶系列擴(kuò)增（如Taq、Tth、AmpliTaq、KlenTaq DNA Polymerase）。 PCR產(chǎn)物（僅有目的條帶、無非特異條帶和引物二聚體）可直接進(jìn)行連接反應(yīng)，無需純化，否則建議膠回收純化（貨號(hào)：DR01)。如果是以質(zhì)粒為模板的PCR產(chǎn)物則最好進(jìn)行純化，因?yàn)槟０遒|(zhì)粒也可能長出菌落（但不是想構(gòu)建的目的載體）。
2.連接反應(yīng)：
1)室溫（20℃-30℃）按照如下體系操作（10ml體系）：
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純化后的PCR產(chǎn)物/或者1ul
1000bp control
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0.5-8ul
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pTOPO-T Vector
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1ul
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10 ′ Enhancer
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1ul
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滅菌水
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Xul
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總體積
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10ul
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加完試劑后，用移液器輕輕吹打混勻或者輕彈管底混勻，低速瞬時(shí)離心收集所有液體在離心管底，
注意此步驟不能在冰上進(jìn)行，只能在室溫（20℃-30℃）進(jìn)行。
注：如果使用5ml體系連接，各成分按照比例減半使用，使用次數(shù)可以加倍。
不同大小插入片段的推薦用量：
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插入片段大?。?span>bp）
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最佳用量（ng）
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100-1000
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20-50
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1000-2000
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50-100
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2000-5000
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100-200
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2)室溫（20℃-30℃）連接5分鐘。
本載體推薦室溫5分鐘完成連接（不要超過5分鐘），但在很多情況下連接1-2分鐘已經(jīng)可以得到足夠多的轉(zhuǎn)化子。
3)連接產(chǎn)物可直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞或貯存于-20℃。
如尚未準(zhǔn)備好感受態(tài)細(xì)胞，可以將連接產(chǎn)物短時(shí)間置于冰上備用。
3.轉(zhuǎn)化：
1)50-100ml感受態(tài)細(xì)胞，置于室溫解凍，完全解凍后（約1分鐘左右）輕撣幾次將細(xì)胞均勻懸浮。
2)加入5ml連接液(最多可全部加入，只要體積不超過感受態(tài)細(xì)胞體積的1/10)，輕輕混勻，室溫放置5分鐘。
根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，本公司載體使用商品化的感受態(tài)細(xì)胞不需要冰浴和熱休克、室溫放置5分鐘便可獲得足夠多轉(zhuǎn)化子，如果實(shí)驗(yàn)室自制感受態(tài)細(xì)胞或者效率較低時(shí)，可以按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。
3)加300-500ml LB或者SOC培養(yǎng)基(不含抗生素)，37℃ 180 rpm振蕩培養(yǎng)10分鐘。
根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，一般可以直接將培養(yǎng)基（事先平衡至室溫） 加入感受態(tài)細(xì)胞的1.5 ml 離心管，蓋上離心管蓋，水平固定在振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)復(fù)蘇即可，不需要轉(zhuǎn)移到試管培養(yǎng)復(fù)蘇。
一般商品化的感受態(tài)細(xì)胞不超過2kb插入片段情況下，10分鐘復(fù)蘇可以得到足夠多轉(zhuǎn)化子，如果使用實(shí)驗(yàn)室自制的感受態(tài)或者插入片段長轉(zhuǎn)化子少的情況下可以提高復(fù)蘇時(shí)間到30-60分鐘以得到更多的轉(zhuǎn)化子。
4)取200ml菌液涂板，培養(yǎng)過夜（如果預(yù)計(jì)轉(zhuǎn)化子少，為得到較多克隆，4000 rpm 離心1 min，吸棄掉部分上清，保留100-150ml，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板）
4.轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定：
本制品陽性率相當(dāng)高，一般情況下，可以達(dá)到所見即所得，只要是長出來的菌落正常（不是污染的雜菌，轉(zhuǎn)化子數(shù)量也不算太少），基本就包含插入。因此插入片段不超過2-3kb的情況下可以不用鑒定直接挑1-2個(gè)菌去測序，。
1)用上述培養(yǎng)的白色菌落的菌液抽提質(zhì)粒，插入片段較大的情況下，直接跑電泳看質(zhì)粒大小就直接能鑒定出有插入的質(zhì)粒，還可用EcoR I/Ecor V雙酶切釋放插入片段或用其它合適的酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢查片段大小，確定是否含有目的片段。
2)挑取菌落直接進(jìn)行PCR檢測（可參見分子克隆第3版本或者咨詢我們）。
3)用通用M13F/M13R引物測序來確定是否含有目的克隆。
pTOPO-T載體圖譜：
pTOPO-T載體通用測序引物序列：
M13F: TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R: CAGGAAACAGCTATGAC
pTOPO-T載體多克隆位點(diǎn)序列：
