Annexin V-Alexa Fluor647/PI Kit凋亡檢測試劑盒
包裝規(guī)格：
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17106-50
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Annexin V-Alexa Fluor647/PI Kit凋亡檢測試劑盒
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50T
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1060元
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17106-100
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Annexin V-Alexa Fluor647/PI Kit凋亡檢測試劑盒
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100T
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1820元
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產(chǎn)品簡介:
細(xì)胞凋亡早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面，這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸(PS)從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，使PS暴露在細(xì)胞膜外表面。PS是一種帶負(fù)電荷的磷脂，正常主要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)面，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細(xì)胞膜外。Annexin V具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性，對PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充當(dāng)一敏感的探針檢測暴露在細(xì)胞膜表面的PS。PS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所獨特的，也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。兩種細(xì)胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細(xì)胞膜是完好的，而細(xì)胞壞死在其早期階段細(xì)胞膜的完整性就破壞了。因此，可以采用AnnexinV與PI雙染的方法，通過流式檢測細(xì)胞早期凋亡。
儲存條件:
2-8℃避光保存,勿冰凍。
注意事項:
本試劑盒需使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。
此產(chǎn)品僅供研究，不用于臨床診斷。
試劑盒組份：
1.結(jié)合緩沖液 4x(Binding Buffer4x)
體積：
50Tests: 10ml（4倍濃縮液）
100Tests: 20ml（4倍濃縮液）
稀釋后溶液中各組分濃度：10mM Hepes/NaOH, pH7.4,140mM NaCl, 2.5mM CaCl2
2.碘化丙錠溶液（ Propidium Iodide, PI）
體積：
50Tests:0.5ml
100Tests:1.0ml
濃度：20ug/ml
3.重組人 Annexin V/Alexa Fluor647, (rh AnnexinV/Alexa Fluor647)
來源：大腸桿菌（E.coli）
分子量：35.8KDa
樣品量：
50Tests: 0.25ml，可用于50次實驗
100Tests: 0.5ml，可用于100次實驗
保存方法：于50mMTris, 100mM NaCl, 1%BSA, 0.02%NaN3,pH7.4溶液中保存。
純度： SDS-PAGE及反相 HPLC表明純度大于 98%
生物活性： AnnexinV可結(jié)合于磷酯酰絲氨酸并表現(xiàn)出抗磷酯酶活性。
操作步驟：
1.細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：
a)對于貼壁細(xì)胞：小心收集細(xì)胞培養(yǎng)液到一離心管內(nèi)備用。用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，至細(xì)胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時，加入前面收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打下所有的貼壁細(xì)胞，并輕輕吹散細(xì)胞。再次收集到離心管內(nèi)。1000rpm左右離心5min，沉淀細(xì)胞。對于特定的細(xì)胞，如果細(xì)胞無法完全離心至離心管底，可以適當(dāng)延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約 50μl左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。加入約1ml 4℃預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清。
b)對于懸浮細(xì)胞： 1000rpm左右離心 5min，沉淀細(xì)胞。對于特定的細(xì)胞，如果細(xì)胞無法完全離心至離心管底，可以適當(dāng)延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約 50μl左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。加入約 1ml4℃預(yù)冷的 PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清。
2.用去離子水按1:3稀釋結(jié)合緩沖液(4ml 4x結(jié)合緩沖液+12ml去離子水 )；
3.用1x結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為 1-5×106/ml；
4.取100μl的細(xì)胞懸液于5ml流式管中，加入 5μlAnnexin V/Alexa Fluor 647混勻后于室溫避光孵育 5分鐘；
5.加入10μl 20ug/ml的碘化丙錠溶液(PI)，并加400μl PBS，立刻進(jìn)行流式檢測。
實驗設(shè)計：
1)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞
空白管：陰性對照組細(xì)胞，不加Annexin V/Alexa Fluor 647，碘化丙錠溶液 (PI)。用于調(diào)節(jié)電壓。
檢測管：處理的細(xì)胞，加 Annexin V/Alexa Fluor 647，碘化丙錠溶液 (PI)。用空白管和單陽管調(diào)節(jié)好電壓補償后，獲得所需要的流式數(shù)據(jù)。
注：無需用單染管 Annexin V/Alexa Fluor 647調(diào)補償。
2)轉(zhuǎn)染GFP細(xì)胞
未轉(zhuǎn)染空白管：未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，不加Annexin V/Alexa Fluor 647，碘化丙錠溶液 (PI)。用于調(diào)電壓。
轉(zhuǎn)染GFP空白管：轉(zhuǎn)染GFP對照組細(xì)胞，不加Annexin V/Alexa Fluor 647，碘化丙錠溶液 (PI)。用于調(diào)補償。
檢測管：處理的細(xì)胞，加Annexin V/Alexa Fluor 647，碘化丙錠溶液 (PI)。調(diào)節(jié)好電壓補償后，獲得所需要的流式數(shù)據(jù)。
常見問題：
1、Annexin V/PI凋亡檢測的試劑盒能否檢測人以外其他動物的細(xì)胞凋亡情況？
可以。因為 Annexin V是與磷脂酰絲氨酸 (PS)親和，而 PS在不同種屬間沒差異。在正常細(xì)胞中， PS只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期， PS由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。
2、貼壁細(xì)胞做凋亡用胰酶消化下來對細(xì)胞膜損傷？
低濃度胰酶消化，輕柔吹打貼壁細(xì)胞 2～3次，離心機 4℃1000rpm 5min離心，處理得當(dāng)?shù)脑?，胰酶造成損傷可以控制在5%以內(nèi)，有對照組的情況下對實驗結(jié)果不會造成明顯影響。
3、貼壁細(xì)胞可以先染 PI然后再消化下來嗎？這樣是否可以減小由于消化液造成的細(xì)胞膜破損而染上的 PI 的誤差？
先加 PI不僅染色是否每組都均勻充分很難判斷，而且 PI本身對細(xì)胞也是有毒性的，對實驗結(jié)果影響會比胰酶大，不建議這樣做。
4、為什么只能用不含 EDTA的胰酶消化貼壁細(xì)胞，用含 EDTA的胰酶消化細(xì)胞對結(jié)果有什么影響？
因為 Annexin V是 Ca依賴的蛋白，所以不能加入 EDTA，防止 EDTA螯合了 Ca離子從而影響 Annexin V，進(jìn)而影響結(jié)果。
5、有些廠家說明書 Annexin V和 PI一起加？為什么你們先加 Annexin V后加 PI？
用流式檢測凋亡時， PI受時間的影響很大，因標(biāo)記了 PI后會加大細(xì)胞毒性，隨著時間延長會導(dǎo)致 PI的染色增加，特別是檢測早期凋亡時，如果時間延長除了會導(dǎo)致在流式細(xì)胞儀上的細(xì)胞分群差距加大外，誤差會明顯加大。一般 PI加上后立刻上機，然后在一個小時內(nèi)檢測完成。兩種方法都可以，但是按照我們操作步驟造成的誤差會更小。
6、你們哪種凋亡檢測試劑盒能用于轉(zhuǎn)染 GFP細(xì)胞的凋亡檢測？
1708 Annexin V-PE/7AAD凋亡檢測試劑盒
1706 Annexin V-Alexa Fluor 647/PI Kit凋亡檢測試劑盒
實驗參考圖：
