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中量質(zhì)粒提取試劑盒（溶液型,無內(nèi)毒素,轉(zhuǎn)染級）

Endo-Free Plasmid Midi Isolation Kit(Solution)

包裝規(guī)格：

一.產(chǎn)品介紹：

   本試劑盒用堿裂解法從培養(yǎng)菌中提取質(zhì)粒DNA，采用獨(dú)特的溶液配方和內(nèi)毒素清除試劑，只需要幾次簡單離心去除蛋白質(zhì)、多糖、內(nèi)毒素、RNA等雜質(zhì)，獲得高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA。純化DNA的OD260/280通常在1.8左右，得到的質(zhì)粒可直接應(yīng)用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染甚至動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)等對DNA純度要求很高的工作中。純化后期過程均在1.5ml小離心管中操作，方法簡單，不需特殊設(shè)備，無需過柱，不用酚氯仿抽提；基本可完全回收細(xì)菌裂解釋放出的質(zhì)粒，不必?fù)?dān)心質(zhì)粒DNA的丟失。本方法提取純化質(zhì)粒DNA，對質(zhì)粒損傷小，即使是10kb甚至100kb以上的大型質(zhì)粒或超大型BAC/PAC質(zhì)粒，只要堿裂解法能夠提取，就可以有效純化。可選擇任意小體積溶解質(zhì)粒，濃度可高達(dá)5μg/μl。超螺旋比例可高達(dá)95%，無內(nèi)毒素，轉(zhuǎn)染效果好。

二.產(chǎn)品特點(diǎn)：
1.不需要使用有毒的苯酚，氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀。快速、 方便、從50-70 ml大腸桿菌LB((Luria-Bertani)培養(yǎng)液中，可快速提取150μg -600μg純凈的高拷貝質(zhì)粒DNA，提取率達(dá)80-90 %。
2.獲得的質(zhì)粒產(chǎn)量高，濃度高，超螺旋比例高，純度好，可直接用于酶切、轉(zhuǎn)化、PCR、體外轉(zhuǎn)錄、測序等各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
3.內(nèi)毒素含量極低（< 0.1 EU/μg DNA），可直接應(yīng)用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

三.儲存條件：
1.第一次使用時，將試劑盒所帶全部的RNase A加入溶液P1后（終濃度100μg /ml）置于4℃保存。如果溶液P1中RNase A失活，提取的質(zhì)粒可能會混雜有微量RNA殘留，在溶液P1中補(bǔ)加RNase A即可。
2.內(nèi)毒素清除劑在4℃可保存一個月，如果要長期保存，建議保存在－20℃!
3.環(huán)境溫度低時溶液P2中SDS可能會析出出現(xiàn)渾濁或者沉淀，可在37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清，不要劇烈搖晃，以免形成過量的泡沫。
4.避免試劑長時間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時蓋緊蓋子。

四.注意事項(xiàng)：
1.提取的質(zhì)粒量與細(xì)菌培養(yǎng)濃度、質(zhì)粒拷貝數(shù)等因素有關(guān)。如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)粒或大于10kb 的大質(zhì)粒，應(yīng)加大菌體使用量，同時按比例增加P1、P2、PⅢ的用量。
2.提取大質(zhì)粒時操作動作要輕柔，應(yīng)該使用剪大了開口的吸頭，防止機(jī)械剪切對DNA的損壞。
3.DNA沉淀液沉淀離心后，可能看不到明顯沉淀。如未見沉淀，擔(dān)心DNA丟失，可保留上清液，待完成全部操作后電泳鑒定，以確定是否獲得終產(chǎn)物（數(shù)百微克DNA離心沉淀在管的側(cè)壁上，可能無法看到明顯團(tuán)塊）。
4.得到的質(zhì)粒DNA可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。OD260值為1相當(dāng)于大約50μg/ml DNA。電泳可能為單一條帶，也可能為2條或者多條DNA條帶，這主要是不同程度的超螺旋構(gòu)象質(zhì)粒泳動位置不一造成，與提取物培養(yǎng)時間長短、提取時操作劇烈程度等有關(guān)。本公司產(chǎn)品正常操作情況下基本超螺旋可以超過95%。
5.質(zhì)粒DNA確切分子大小， 必須酶切線性化后，對比DNA分子量Marker才可以知道。處于環(huán)狀或者超螺旋狀態(tài)的質(zhì)粒，泳動位置不確定，無法通過電泳知道確切大小。

五.操作步驟：（實(shí)驗(yàn)前請先閱讀注意事項(xiàng)）
  提示：將RNase A全部加入溶液P1中，混勻，使用后置于2-8℃保存。
1.取過夜培養(yǎng)菌40-60ml（最大不超過90 ml）菌液，裝入50ml離心管中，4,500~6,000 x g于4℃離心5 min沉淀菌體（也可12,000 x g離心2分鐘），完全棄除上清。

2.加入2.5 ml 溶液P1，充分混懸震蕩菌體沉淀，使其完全分散開，至無絮塊存在。室溫放置3~5 min。  
如果有未徹底混勻的菌塊，會影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低。

3.加入2.5 ml 溶液P2，輕輕顛倒離心管6~8次，室溫放置5 min，使細(xì)菌完全裂解，溶液透明。
溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免基因組DNA剪切斷裂！所用時不應(yīng)超過5分鐘！以免質(zhì)粒受到破壞。此時菌液應(yīng)變得清亮粘稠，如果菌體少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要準(zhǔn)確的5分鐘。如果未變得清亮，可能由于菌體過多，裂解不徹底，應(yīng)減少菌體量。

4.加2.5 ml溶液PⅢ，立即顛倒離心管6~8次，充分混勻，至白色絮狀物產(chǎn)生。上述裂解液于4℃ 12,000~16,000 x g離心10~15 min，小心吸出上清，移入新的50 ml離心管中。
加入溶液PⅢ后應(yīng)該立即混勻，以免產(chǎn)生SDS的局部沉淀。
注意：使用異丙醇沉淀，蛋白雜質(zhì)和鹽離子共沉淀較少，可能看不到明顯的較大團(tuán)塊沉淀，但是質(zhì)粒還是可以完全沉淀下來，不影響實(shí)際的質(zhì)粒產(chǎn)量。如果你習(xí)慣看見較大的沉淀團(tuán)塊操作，可以選擇2倍體積的無水乙醇沉淀。

5.加入5 ml 異丙醇，顛倒離心管，充分混勻。

6.于4℃ 12,000~16,000 x g離心10 min，小心棄去上清，倒置于吸水紙上輕輕瀝干殘余液體，加入3-5ml 70%乙醇漂洗一遍，最高速離心5分鐘，棄上清，晾干沉淀。
DNA沉淀如果干燥過頭，DNA將無法完全溶解，但是如果乙醇沒有晾干揮發(fā)干凈，殘留太多，也會造成DNA無法完全溶解。
注意：異丙醇離心沉淀后，質(zhì)粒純度很高吸附在管底和側(cè)壁可能看不見沉淀，但是不影響產(chǎn)量，后續(xù)步驟仔細(xì)吹打管底和沉淀所在的側(cè)壁涮洗溶解質(zhì)粒。

7.加入0.7 ml 溶液P1完全溶解沉淀團(tuán)塊，注意附著在管底和側(cè)壁上的質(zhì)粒沉淀雖然可能看不見，也要吹打管底和沉淀所在的側(cè)壁涮洗下來（大質(zhì)粒可用寬口吸管輕輕吹打輔助溶解）。然后將質(zhì)粒溶液轉(zhuǎn)入1個新的1.5 ml離心管中。

可選步驟（一般不需要）：如果菌株RNA豐富有微量RNA殘留，可在此步驟后將質(zhì)粒溶液 60℃孵育15 min消化RNA。
8. 加入55μl雜質(zhì)清除液A，顛倒充分混勻后加入約0.1體積(約80μl)冰預(yù)冷的內(nèi)毒素清除劑，顛倒旋轉(zhuǎn)7-10次（30秒左右）充分混勻，冰浴或者冰上放置>=5分鐘，中間偶爾顛倒混勻幾次。
內(nèi)毒素清除劑加入上清后，上清會變得渾濁，但是冰浴后應(yīng)恢復(fù)清亮。
注意：如果不需要去內(nèi)毒素用于轉(zhuǎn)染，可在此步驟只加入55μl雜質(zhì)清除液A，充分混勻后冰上放置5分鐘，離心后小心取上清轉(zhuǎn)入一個新管，直接接步驟11。

9.42℃水浴，溶液又會變?yōu)闇啙幔嵉够靹蚝?2℃溫育5分鐘。

10.室溫14,000 x g離心5 min分相（溫度低時，內(nèi)毒素清除劑無法分相，因此必須至少20℃以上室溫離心或者保證冬季轉(zhuǎn)頭溫度20℃以上）。上層水相含DNA，下層藍(lán)色油狀相含內(nèi)毒素和其它雜質(zhì)。將含DNA的上層水相轉(zhuǎn)移到新管（注意不要吸到藍(lán)色油狀層，里面含內(nèi)毒素等雜質(zhì)），棄油狀層。
溶液必須分為上下兩相，否則應(yīng)重復(fù)步驟9-10。

11.將上一步所得上層水相中加入等體積雜質(zhì)清除液B（約750μl），輕柔混勻，4℃ 14,000 x g離心10 min，棄上清（注意不要丟失DNA），輕輕加入1 ml 70%乙醇洗滌，離心棄上清，共兩次，室溫倒置晾干5~10 min使乙醇完全揮發(fā)。

12.加適量TE或者純水（50~100μl）溶解沉淀（可在37℃水浴中振蕩以輔助溶解）。要注意很多質(zhì)粒DNA可能附著在離心管側(cè)壁上，即使看不見，也應(yīng)該充分吹打側(cè)壁溶解回收質(zhì)粒DNA。

最后沉淀可以根據(jù)需要選擇任意小體積溶解，這樣可以得到很高濃度的轉(zhuǎn)染級質(zhì)粒DNA（高達(dá)5-10μg/μl）。如果有需要，客戶也可以選擇更大體積溶解。