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高純度質(zhì)粒大量快速提取試劑盒(離心柱型)

HighPure Plasmid Maxi Extraction Kit(Column)

包裝規(guī)格：

產(chǎn)品介紹：
本試劑盒采用改進(jìn) SDS-堿裂解法裂解細(xì)胞，離心吸附柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜在高鹽、低pH 值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒 DNA，再通過去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除，最后低鹽、高 pH 值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒 DNA 從硅基質(zhì)膜上洗脫。

儲存事項:
1. 第一次使用時， 將試劑盒所帶全部的RNaseA加入溶液P1后（ 終濃度100μg/ml ）置于4 ℃ 保存 。如果溶液 P1 中 RNase A 失活，提取的質(zhì)?？赡軙形⒘?RNA 殘留，在溶液 P1 中補加 RNase A 即可。
2. 環(huán)境溫度低時溶液 P2 中 SDS 可能會析出出現(xiàn)渾濁或者沉淀，可在 37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清，不要劇烈搖晃，以免形成過量的泡沫。
3. 避免試劑長時間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH 值變化，各溶液使用后應(yīng) 及時蓋緊蓋子。

產(chǎn)品特點：
1. 離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜采用進(jìn)口公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復(fù)性好。克服了國產(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。
2. 不需要使用有毒的苯酚、氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀?？焖佟⒎奖?，從100-200ml 大腸桿菌 LB((Luria-Bertani)培養(yǎng)液中，可快速提取 0.2-0.5mg 純凈的高拷貝質(zhì)粒 DNA，提取率達(dá) 80 %左右。
3. 獲得的質(zhì)粒產(chǎn)量高、超螺旋比例高、純度好，可以直接用于酶切、轉(zhuǎn)化、PCR、
體外轉(zhuǎn)錄、測序等各種分子生物學(xué)實驗。

注意事項：
1. 所有的離心步驟如未加另外說明均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到12,000xg，帶50ml轉(zhuǎn)頭的臺式離心機。
2. 溶液P3和去蛋白液PD中含有刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套， 避免沾染皮膚 、眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。
3. 提取質(zhì)粒的量與細(xì)菌培養(yǎng)濃度、質(zhì)粒拷貝數(shù)等因素有關(guān)。如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)?；虼笥?0kb 的大質(zhì)粒，應(yīng)加大菌體使用量，同時按比例增加P1、P2、P3的用量，洗脫緩沖液應(yīng)在70℃預(yù)熱?？梢赃m當(dāng)?shù)难娱L吸附和洗脫的時間，提高提取效率。
4. 得到的質(zhì)粒DNA可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。OD260值為1相當(dāng)于大約50μg/ml DNA。 電泳可能為單一條帶，也可能為2 2 2 2 條或者多條DNA 條帶 ，這主要是不同程度的超螺旋構(gòu)象質(zhì)粒泳動位置不一造成，與提取物培養(yǎng)時間長短、提取時操作劇烈程度等有關(guān)。 本公司產(chǎn)品正常操作情況下基本超螺旋可以超過 90% 。
5. 質(zhì)粒 DNA 確切分子大小， 必須酶切線性化后，對比DNA分子量Marker才可以知道 。處于環(huán)狀或者超螺旋狀態(tài)的質(zhì)粒，泳動位置不確定，無法通過電泳知道其確切大小。
6. 洗脫液 EB 不含有螯合劑 EDTA ，不影響下游酶切、連接等反應(yīng)。 也可以使用水洗脫，但應(yīng)該確保 pH 大于 7.5 ，pH過低影響洗脫效率。用水洗脫，質(zhì)粒應(yīng)該保存－20℃。質(zhì)粒DNA如果需要長期保存，可以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影響下游酶切反應(yīng)，使用時可以適當(dāng)稀釋。

操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）
提示：
第一次使用前請先在漂洗液 WB 瓶中加入指定量無水乙醇，充分混勻，加入后請及時在方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入!
將 RNaseA 全部加入溶液 P1 中，混勻。每次使用后置于 2-8℃保存。
將溶液 P3 放在冰上預(yù)冷。
1. 取 150-200 毫升過夜培養(yǎng)的菌液，12,000xg，離心 1-2 分鐘，盡可能的倒干上清 ，收集菌體。
收集超過50毫升菌液，可以離心棄上清后，在同一個50ml管內(nèi)加入更多的菌液 ，
重復(fù)步驟 1，直到收集到足夠的菌體。
2. 用 7ml 溶液 P1 重懸菌體沉淀，移液器吹打或者渦旋振蕩至徹底懸浮。
如果有未徹底混勻的菌塊，會影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低。
3. 加 7ml 的溶液 P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn) 4 -7 次使菌體充分裂解，室溫放置 3-5 分鐘。
溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免基因組 DNA  剪切斷裂！所用時間不應(yīng)超過 5分鐘 ！ 以免質(zhì)粒受到破壞 。 此時菌液應(yīng)變得清亮粘稠 。 如果 很渾濁 ， 可能由于菌體過多，裂解不徹底，應(yīng)減少菌體量。
4. 加 10ml 溶液 P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn) 4 -7 次，充分混勻此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。室溫或者冰上靜置5分鐘，4℃ ，12,000xg 離心15分鐘，小心取上清，避免吸取到漂浮的白色沉淀。
加入溶液P3后應(yīng)該立即混勻 ， 以免產(chǎn)生SDS的局部沉淀 ， 如果上清中還有 飄浮白色沉淀，可再次離心后取上清。
5. 可選 （一般不需要做）:4℃，12,000xg 再次離心 10 分鐘，小心取上清。
6. 將上一步所得上清分多次（每次不超過 15ml）轉(zhuǎn)入吸附柱 DC 中（吸附柱放入收集管中），12,000xg 離心 1 分鐘，倒掉收集管中的廢液。
7.加入 10ml 去蛋白液 PD，12,000xg 離心 1 分鐘，棄掉廢液。
8. 加入 10ml 漂洗液 WB （請先檢查是否已加入無水乙醇!） ），12,000xg 離心 1 分鐘 ，棄掉廢液。
9. 重復(fù)操作步驟 8 一次。
10. 將吸附柱 DC 放回空收集管中，最高速（最好大于 12,000xg）離心 5 分鐘以干燥膜基質(zhì)殘留乙醇，用槍頭吸除內(nèi)圈壓環(huán)和柱壁之間可能殘留的乙醇，室溫或者烘箱晾干幾分鐘。
該步驟目的為徹底去除吸附柱中殘留乙醇 ， 殘留乙醇抑制下游反應(yīng)并且嚴(yán)重降低洗脫效率，降低質(zhì)粒產(chǎn)量驟 。如果洗脫產(chǎn)量低，則必須加做步驟  11 。
11. 可選步驟:選擇以下兩種方法之一干燥柱子：
1) 取下柱子放置于真空容器中，密封真空容器，提供真空 15 分鐘；
2) 將柱子放置于 60－65℃真空干燥箱或烘箱中，放置 10-15 分鐘。
12. 取出吸附柱 DC，放入一個干凈的離心管中， 在吸附膜的中間部位加 1-2ml 洗脫緩沖液 EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水浴中預(yù)熱效果更好），室溫放置 2-5 分鐘，12,000xg 離心 5 分鐘。如果需要較多量質(zhì)粒，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，離心2分鐘。
洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要質(zhì)粒濃度較高，可以適當(dāng)減少洗脫體積 ，
但是最小體積不應(yīng)少于1ml，體積過小降低質(zhì)粒洗脫效率，減少質(zhì)粒產(chǎn)量。

問題與解決方法：