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無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量提取試劑盒(離心柱型)

Endo-Free Plasmid Midi Extraction Kit(Column)

包裝規(guī)格：

一.產(chǎn)品介紹：
   本試劑盒采用改進(jìn)SDS-堿裂解法裂解細(xì)胞，通過(guò)獨(dú)特的內(nèi)毒素清除劑選擇性結(jié)合離心除去內(nèi)毒素，然后離心吸附柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜在高鹽、低pH值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA，再通過(guò)去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除，最后低鹽、高pH值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

二.產(chǎn)品特點(diǎn)：
1.離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜采用進(jìn)口公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復(fù)性好?？朔藝?guó)產(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。
2.獨(dú)特工藝配方清除內(nèi)毒素，內(nèi)毒素含量極低（<0.1 EU/μg DNA），細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果極佳。也可直接用于酶切、轉(zhuǎn)化、PCR、體外轉(zhuǎn)錄、測(cè)序、等各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

三.儲(chǔ)存條件：
1.第一次使用時(shí)，將試劑盒所帶的全部RNase A加入溶液P1后（終濃度100ug/ml）置于2-8℃保存。如果溶液P1中RNase A失活，提取的質(zhì)?？赡軙?huì)有微量RNA殘留，在溶液P1中補(bǔ)加RNase A即可。
2.環(huán)境溫度低時(shí)溶液P2中SDS可能會(huì)析出渾濁或者沉淀，可在37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清，不要?jiǎng)×覔u晃，以免形成過(guò)量的泡沫。
3.避免試劑長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時(shí)蓋緊蓋子。

三.注意事項(xiàng)：
1.所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13,000rpm的傳統(tǒng)臺(tái)式離心機(jī)，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機(jī)。
2.提取質(zhì)粒的量與細(xì)菌培養(yǎng)濃度、質(zhì)粒拷貝數(shù)等因素有關(guān)。一般高拷貝質(zhì)粒， 過(guò)夜培養(yǎng)14-16個(gè)小時(shí)，5-15ml 培養(yǎng)物可提取出15-70μg的純凈質(zhì)粒。如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)?；虼笥?0kb的大質(zhì)粒，應(yīng)適當(dāng)加大菌體使用量，同時(shí)按比例增加P1、P2、N3的用量，其它步驟相同。
3.得到的質(zhì)粒DNA可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度。OD260值為1相當(dāng)于大約50μg/ml DNA。電泳可能為單一條帶，也可能為2條或者多條DNA條帶，這主要是不同程度的超螺旋構(gòu)象質(zhì)粒泳動(dòng)位置不一造成，與提取物培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短、提取時(shí)操作劇烈程度等有關(guān)。本公司產(chǎn)品正常操作情況下基本超螺旋可以超過(guò)90%。
4.質(zhì)粒DNA確切分子大小， 必須酶切線性化后，對(duì)比DNA分子量Marker才可以知道。處于環(huán)狀或者超螺旋狀態(tài)的的質(zhì)粒，泳動(dòng)位置不確定，無(wú)法通過(guò)電泳知道其確切大小。
5.洗脫液EB不含有螯合劑EDTA，不影響下游酶切、連接等反應(yīng)。也可以使用水洗脫，但應(yīng)該確保pH大于7.5，pH過(guò)低影響洗脫效率。用水洗脫質(zhì)粒應(yīng)該保存在－20℃。質(zhì)粒DNA如果需要長(zhǎng)期保存，可以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影響下游酶切反應(yīng)，使用時(shí)可以適當(dāng)稀釋。

關(guān)于平衡液的使用
1.介紹：核酸吸附硅膠膜柱子長(zhǎng)期放置過(guò)程中會(huì)同空氣中的電荷/塵埃發(fā)生反應(yīng)而影響其核酸的結(jié)合能力。硅膠柱經(jīng)平衡液預(yù)處理后可大大減少柱子中硅膠膜的憎水基團(tuán)，提高核酸的結(jié)合能力。從而提高硅膠柱子回收效率或者產(chǎn)量。平衡液是強(qiáng)堿性溶液，若不小心碰到，請(qǐng)用大量自來(lái)水清洗。用完后需蓋緊瓶蓋，以免接觸空氣。室溫保存。在保存過(guò)程中可能有沉淀生成，請(qǐng)加熱至37℃使沉淀完全消失。
2.使用方法：取一個(gè)新的硅膠膜吸附柱子裝在收集管中，吸取100μl的平衡液至柱子中。13000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中廢液，將吸附柱子重新放回收集管。此時(shí)平衡液預(yù)處理柱子完畢。接后續(xù)的操作步驟。

四.操作步驟：（實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)先閱讀注意事項(xiàng)）
提示：
    第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液WB瓶中加入指定量無(wú)水乙醇，充分混勻，加入后請(qǐng)及時(shí)在方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入!
    將RNase A全部加入溶液P1中，混勻，每次使用后置于2-8℃保存。

1.取5-15 ml毫升過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，9,000rpm離心1-2分鐘，盡可能的倒干上清，收集菌體。

2.用500μl溶液P1重懸菌體沉淀，渦旋振蕩至徹底懸浮，全部轉(zhuǎn)入一個(gè)2ml離心管。  
如果有未徹底混勻的菌塊，會(huì)影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低。

3.加500μl的溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6 -8次使菌體充分裂解，室溫放置4分鐘。
溫和地混合，不要?jiǎng)×艺鹗帲悦饣蚪MDNA剪切斷裂！所用時(shí)間不應(yīng)超過(guò)5分鐘！以免質(zhì)粒受到破壞。此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮粘稠，如果菌體少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要準(zhǔn)確的5分鐘。

4.加500μl溶液N3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6 -8次，充分混勻時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。13,000rpm離心10分鐘，小心取上清至新管，避免吸取到漂浮白色沉淀。

5.加入0.1體積(上清的體積的10%，約160μl)的內(nèi)毒素清除劑到上一步所得上清，顛倒旋轉(zhuǎn)混勻，冰浴或者插入碎冰中(或冰箱冷凍室)放置5分鐘直到渾濁變清亮透明（或仍舊稍有渾濁），中間偶爾混勻幾次。
內(nèi)毒素清除劑加入上清后，上清會(huì)變得渾濁，但是冰浴后應(yīng)恢復(fù)清亮（或稍渾濁）。

6.常溫放置3-5分鐘，溫度恢復(fù)室溫溶液很快變?yōu)闇啙?，顛倒混勻?br /> 如室內(nèi)溫度較低或者想加快速度可以在37-42℃水浴，將很快變渾濁，顛倒混勻。

7.室溫14,000 x g離心10 分鐘分相 。上層水相含DNA，下層藍(lán)色油狀相含內(nèi)毒素和其它雜質(zhì)。將含DNA的上層水相轉(zhuǎn)移到新管（注意不要吸到藍(lán)色油狀層，里面含內(nèi)毒素等雜質(zhì)），棄油狀層。

平衡液預(yù)處理吸附柱：
使用平衡液預(yù)處理硅膠膜吸附柱為必做步驟，具體方法參見(jiàn)前文“關(guān)于平衡液的使用”

8.向上層水相中加入0.5體積異丙醇（約740μl）后充分顛倒混勻后分多次（每次不超過(guò)700μl）轉(zhuǎn)入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12,000 x g離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。直到所有混合溶液通過(guò)此吸附柱。

9.加入600μl漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇!），12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。再加入600μl漂洗液WB，重復(fù)漂洗一次。

10.將吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。

11.取出吸附柱AC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100-200μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水浴中加熱效果更好），室溫放置2分鐘，12,000rpm 離心1分鐘。如果需要較多量質(zhì)粒，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，離心1分鐘。

洗脫體積越大，洗脫效率越高。如果需要質(zhì)粒濃度較高，可以適當(dāng)減少洗脫體積， 但是最小體積不應(yīng)少于100μl，體積過(guò)小降低質(zhì)粒洗脫效率，減少質(zhì)粒產(chǎn)量。