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Exo-DNA恒溫快速擴增試劑盒(熒光型)

包裝規(guī)格：

用于DNA擴增，熒光檢測

一. 原理概述：
本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴增技術(shù)：在常溫恒溫下，重組酶和引物形成蛋白/單鏈核苷酸的復(fù)合體Rec/ssDNA，在輔助蛋白和單鏈結(jié)合蛋白SSB的幫助下，侵入雙鏈DNA模板；在侵入位點形成D-loop區(qū)域，并開始對DNA雙鏈進(jìn)行掃描；待找到與引物互補的目的區(qū)域后，復(fù)合體Rec/ssDNA解體的同時，聚合酶也結(jié)合到引物的3’末端，開始鏈的延伸。本試劑盒在39 oC下，依賴核酸外切酶的作用，加入根據(jù)模版設(shè)計的特異的分子探針，使用熒光監(jiān)測設(shè)備能實現(xiàn)對目標(biāo)片段擴增過程的實時監(jiān)控。

二. 產(chǎn)品特點：
本試劑盒具有靈敏度高、特異性強、反應(yīng)時間短（僅需20 mins）等優(yōu)點，反應(yīng)組分為干粉狀態(tài)，操作簡便，易于保存。

可適用于各種品牌的熒光定量PCR儀、恒溫?zé)晒鈹U增儀器等熒光檢測設(shè)備。

三. 引物設(shè)計：
1. 建議使用長度在30-35 bp的引物，引物過短會影響擴增速度和檢測靈敏度；

2. 堿基排布隨機性高，GC 含量在 30%-70%之間；

3. 引物設(shè)計避免形成二級結(jié)構(gòu)而影響擴增；

4. 擴增子長度建議在150-300 bp，通常不超過500 bp。

四. 熒光探針設(shè)計：
在上下游引物中間，設(shè)計一段長度為 46-52nt 與目的片段互補的序列作為熒光探針；

探針序列不與特異性引物識別位點重疊，長度為46-52 nt，序列避免回文序列、內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)和連續(xù)的重復(fù)堿基。

探針共有四個修飾位點：

1. 距離 5’端的 30-35 nt 的中部位置標(biāo)記一個 dSpacer（四氫呋喃，THF），作為核酸外切酶的識別位點（任何堿基，無特殊要求）；
2. THF 位點的上游的 T 堿基上標(biāo)記一個熒光基團(tuán)（如 FAM），下游在 T 堿基上標(biāo)記一個淬滅基團(tuán)（如BHQ1），兩個基團(tuán)的間距為 2-4 nt；
3. THF 距離 3’末端約 15 nt，并且 3’末端標(biāo)記一個修飾基團(tuán)，例如胺基、磷酸基團(tuán)或 C3-spacer。

五. 試劑盒儲存：
運輸條件：低溫運輸；
儲存條件：儲存溫度 ≤ -20 oC，避光保存，避免重壓、反復(fù)凍融；
產(chǎn)品有效期：12個月。 

六. 操作步驟：

提前30分鐘將試劑盒所需組分取出，室溫融化，震蕩混勻。

1.  每個干粉反應(yīng)管加入32.9 μL A buffer（注意：A buffer需完全融化混勻，否則會對實驗效果產(chǎn)生影響）；

2.  每個反應(yīng)管分別加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探針（引物和探針濃度為10 μM，對于多個反應(yīng)、步驟1和步驟2可以混合后再分裝至反應(yīng)管中）；

3.  向反應(yīng)管中依次加入8 μL ddH2O和2 μL核酸模板（可根據(jù)核酸濃度調(diào)整加入的核酸模板體積，并相應(yīng)調(diào)整加入的ddH2O體積，至模板與ddH2O總體積為10 μL）；

4.  最后向反應(yīng)管中加入2.5 μL B Buffer并充分混合（對于多個反應(yīng)，建議將B Buffer加至反應(yīng)管的蓋子內(nèi)側(cè)，上下顛倒反應(yīng)管8-10次混勻）；

5.  混勻后，將反應(yīng)液甩（或快速離心）至管子底部，然后立即將反應(yīng)管放入熒光檢測設(shè)備中。熒光檢測程序設(shè)置為：恒溫39 oC預(yù)熱1min，恒溫擴增39 oC，30sec/循環(huán)，40個循環(huán)，每30 sec采集一次FAM通道（信號采集通道的選擇與熒光探針設(shè)計一致）熒光值；反應(yīng)時間20 min。
注：如使用ABI系列PCR儀，請務(wù)必于passive reference和quencher處均選擇“none”。

*正對照反應(yīng)單元體系配制：陽性/陰性對照模板加入2μL，正對照引物探針C Buffer（包含探針和上/下游引物）加入4.6 μL，其他組分參照體系配制A Buffer 32.9 μL，ddH2O 8 μL，B Buffer 2.5 μL，總體積50 μL。

注意事項：
1．由于試劑盒靈敏度非常高，在進(jìn)行反應(yīng)時請注意避免微量待擴增DNA的污染，并盡量考慮設(shè)置空白對照以確認(rèn)是否有待擴增DNA的污染。

2．試劑盒保質(zhì)期12個月。每次使用時，請取出實驗所需的MIRA反應(yīng)單元的數(shù)量，置于冰浴條件下并在8小時內(nèi)使用；剩余部分，請置于存儲條件下。