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Basic-DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(基礎(chǔ)型)

包裝規(guī)格：

用于DNA擴(kuò)增，電泳檢測(cè)

一.技術(shù)介紹：

本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)：在常溫恒溫下，重組酶和引物形成蛋白/單鏈核苷酸的復(fù)合體Rec/ssDNA，在輔助蛋白和單鏈結(jié)合蛋白SSB的幫助下，侵入雙鏈DNA模板；在侵入位點(diǎn)形成D-loop區(qū)域，并開(kāi)始對(duì)DNA雙鏈進(jìn)行掃描；待找到與引物互補(bǔ)的目的區(qū)域后，復(fù)合體Rec/ssDNA解體的同時(shí)，聚合酶也結(jié)合到引物的3’末端，開(kāi)始鏈的延伸。

二.產(chǎn)品特點(diǎn)：

本試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)時(shí)間短（僅需30 mins）等優(yōu)點(diǎn)，反應(yīng)組分為干粉狀態(tài)，操作簡(jiǎn)便，易于保存。
金屬浴、水浴鍋等即可進(jìn)行反應(yīng)操作，無(wú)需購(gòu)買(mǎi)PCR擴(kuò)增儀等價(jià)格高昂的專屬設(shè)備。

三.引物設(shè)計(jì)：

1. 建議使用長(zhǎng)度在30-35 bp的引物，引物過(guò)短會(huì)影響擴(kuò)增速度和檢測(cè)靈敏度；

2. 堿基排布隨機(jī)性高，GC 含量在 30%-70%之間；

3. 引物設(shè)計(jì)避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)而影響擴(kuò)增；

4. 擴(kuò)增子長(zhǎng)度建議在150-300 bp，通常不超過(guò)500 bp。

四.操作步驟：
提前30分鐘將試劑盒所需組分取出，室溫融化，震蕩混勻。

1. 每個(gè)干粉反應(yīng)管加入32.9 μL A buffer（注意：A buffer需完全融化混勻，否則會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)效果產(chǎn)生影響）；

2. 每個(gè)反應(yīng)管分別加入2 μL上游引物和2 μL下游引物（引物濃度10 μM，對(duì)于多個(gè)反應(yīng)、步驟1和步驟2可以混合后再分裝至反應(yīng)管中）；

3. 向反應(yīng)管中依次加入8.6 μL ddH2O和2 μL核酸模板（可根據(jù)核酸濃度調(diào)整加入的核酸模板體積，并相應(yīng)調(diào)整加入的ddH2O體積，至模板與ddH2O總體積為10.6 μL）; 

4. 最后向反應(yīng)管中加入2.5 μL B Buffer并充分混合（對(duì)于多個(gè)反應(yīng)，建議將B Buffer加至反應(yīng)管的蓋子內(nèi)側(cè)，上下顛倒反應(yīng)管8-10次混勻）；

5. 混勻后，將反應(yīng)液甩（或快速離心）至管子底部，然后立即將反應(yīng)管放入恒溫設(shè)備中37-39 oC孵育30 mins；

6. 反應(yīng)結(jié)束后，加入50 μL酚/氯仿，1:1抽提反應(yīng)溶液，12000 rpm離心5 min，取5 μL上清進(jìn)行電泳檢測(cè)或者使用DNA產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行處理，貨號(hào)：P2303，50次，PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒。

*正對(duì)照反應(yīng)單元體系配制：陽(yáng)性/陰性對(duì)照模板加入2μL，正對(duì)照引物C Buffer（包含上/下游引物）加入4 μL，其他組分參照體系配制A Buffer 32.9 μL，ddH2O 8.6 μL，B Buffer 2.5 μL，總體積50 μL。

注意事項(xiàng)：
1．由于試劑盒靈敏度非常高，在進(jìn)行反應(yīng)時(shí)請(qǐng)注意避免微量待擴(kuò)增DNA的污染，并盡量考慮設(shè)置空白對(duì)照以確認(rèn)是否有待擴(kuò)增DNA的污染。

2．試劑盒保質(zhì)期12個(gè)月。每次使用時(shí)，請(qǐng)取出實(shí)驗(yàn)所需的MIRA反應(yīng)單元的數(shù)量，置于冰浴條件下并在8小時(shí)內(nèi)使用；剩余部分，請(qǐng)置于存儲(chǔ)條件下。